Técnicas RT-qPCR y ELISA para el diagnóstico de COVID-19: una comparación y elección para el contexto colombiano.

Síntesis.
Johnson-A, Jorge-H
Ing. y Est. Biol (Eafit)
 
Resumen.
El mundo entero se comenzó a enfrentar a una pandemia cuyo origen se ubicó geográficamente en la localidad de Wuhan en diciembre de 2019. El virus, un coronavirus al que se le denominó SARS-CoV-2 por su relación filogenética con otros coronavirus, como el SARS-CoV y el MERS-CoV, ha puesto a temblar las economías del mundo, y ha hecho que el sector salud se vea enfrentado a una escasez en recursos médicos al no estar preparados para tal crisis pandémica. Dado lo novedoso del virus, las pruebas diagnósticas escasean, no hay vacunas, y los tratamientos son improvisados. Muchas pruebas diagnósticas se vienen utilizando en todo el mundo: en particular hay dos pruebas muy sensibles y específicas: la prueba especializada RT-qPCR y la prueba ELISA bastante poderosa y fácil de usar. A pesar de que ambas tienen sus ventajas y desventajas, la revisión del contexto colombiano, un país pobre debido a sus altos índices de corrupción, en donde hay poco entrenamiento en técnicas biomoleculares, y poco recurso científico, deja claro que se debe trabajar con pruebas de bajo costo, fáciles de usar, y que entreguen resultados lo más inmediatos posibles.
ELISA entonces se convierte en una excelente prueba candidata. Colombia usa POCT (Point Of Test Care) de bajo costo que no compite con ninguna de estas dos técnicas en calidad de resultados, y solo procede con una prueba RT-qPCR en aquellos casos en que, por suerte, no salgas falso negativo.
Keywords: COVID-19, SARS-CoV-2, RT-qPCR, ELISA, técnica molecular
​

---

Introducción.
La declaración de pandemia de parte de la OMS en febrero del 2020, pandemia viral que tuvo su origen en los mercados callejeros de la población china de Wuhan en diciembre de 2019 (Zhou, et al., 2020), trajo consigo en todos los países del mundo bloqueos y restricciones de fronteras geopolíticas, y una cuarentena civil en casi todas sus ciudades, con la idea de mitigar la velocidad de propagación de la infección del virus, y evitar así colapsar los sistemas de salud.
La enfermedad COVID-19, como se le llama a la enfermedad causada por el nuevo virus, el Coronavirus SARS-CoV-2 protagonista de la pandemia, pertenece filogenéticamente a la subfamilia Orthocoronavirinae, familia  Coronaviridae, orden Nidovirales, y reino Riboviria. Entre sus cuatro géneros 𝜶, 𝜷, 𝜸, y 𝜹, el SARS-CoV-2 es un Betacoronavirus: estos virus tienen cubierta (cápside), que contiene genoma de una sola hebra de ARN de sentido positivo. Otros coronavirus que también infectan humanos son los coronavirus 𝜶 HCoV-229E y NL63, y los coronavirus 𝜷 MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43 y HCoV-HKU1 (Li, Geng, Peng, Meng y Lu, 2020).
Al momento de escribir este texto, el sector salud libra una dura batalla contra una entidad viral que ya deja millón y medio de infectados y una proporción de muertes sobre infectados de casi el 6% a nivel mundial.  Las herramientas del personal médico en los distintos hospitales del mundo van desde el diagnóstico de la enfermedad, hasta las terapias en los casos confirmados para COVID-19. En este documento, nos enfocaremos sólo en la comparación de dos técnicas de diagnóstico molecular para determinar si un paciente está infectado con el coronavirus: la técnica RT-PCR (de sus siglas en inglés Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) y la técnica ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay). Analizaremos sus pro y contras de cara a la situación actual de la pandemia en Colombia y el mundo.

Herramientas diagnósticas.
Como cualquier diagnóstico, establecer si una persona está enferma con COVID-19 requiere de procedimientos y técnicas que certifiquen con alto grado de probabilidad que no se trata de otra enfermedad. Normalmente los primeros pasos para la aproximación a un paciente es la revisión sintomatológica dirigida a establecer una patogénesis (del griego πάθος, páthos, sufrimiento y γένεσις, génesis, origen). Pero debido a que la enfermedad es muy nueva, se asume una sintomatología similar a enfermedades que han sido generadas por patógenos en la misma línea filogenética del SARS-CoV-19, como lo son el SARS-CoV y MERS-CoV. Hay que revisar entonces si las manifestaciones clínicas del paciente corresponden a algunas de las descritas para esas enfermedades, como lo enumeradas por Li et al. (2020).  Debido a que la sintomatología no es suficiente sino para generar un marco de trabajo clínico, en momento posterior se debe establecer si la enfermedad que presenta el paciente es precisamente un ataque viral por SARS-CoV-2. En este sentido, la identificación del patógeno demanda un análisis de su estructura, lo que implica un estudio detallado del estado actual del paciente, como por ejemplo, hacer un cultivo desde el paciente para aislar el posible virus, y determinar la presencia a través de un secuenciado y análisis genómico; de ese modo se podrá establecer si efectivamente se trata del virus SARS-CoV-2. Dentro del conjunto de herramientas diagnósticas con las que cuenta un profesional de la salud, encontramos dos técnicas de análisis para establecer si un paciente contrajo la enfermedad COVID-19: la técnica rRT-PCR y la técnica ELISA. ​

Real time Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (rRT-PCR).  La reacción en cadena de polimerasa o PCR (de sus siglas en inglés Polymerase Chain Reaction), es un método común para amplificar ADN. La técnica parte de una pequeña muestra de un fragmento de ADN para obtener millones de copias usando Thermus aquaticus (Taq) polimerasa y las variaciones a este procedimiento estandard va a depender del objetivo molecular.
La transcripción inversa o  RT-PCR puede ser usada para fabricar DNA desde una plantilla de ARN, útil en el caso de la detección viral. La RT-PCR usa enzimas retrovirales (reverse transcriptase) para convertir RNA en ADN complementario (cDNA). Para cuantificar la cantidad inicial de material de ADN o ARN en una muestra, se una un procedimiento denominado PCR cuantitativo o qPCR, de sus siglas en inglés 'quantitative PCR. Esta técnica usa fluorescencia para monitorear la amplificación de la molécula de ADN durante la PCR en tiempo real y no al final como la técnica convencional. La técnica qPCR usa amplicones (específicos o no específicos) etiquetados con fluorescencia que dan un resultado inmediato, evitando así la necesidad de purificaciones y visualizaciones posteriores por electroforesis. La acumulación del ADN objetivo es monitoreada durante el proceso qPCR, y un patógeno particular puede detectarse en varias horas, en vez de esperar el resultado del proceso de un día para otro (Madigan, et. al, 2019), lo que representa una ventaja frente a las técnicas convencionales.
Luego que la pandemia del SARS-CoV-2 comenzó en China, muchas compañías lanzaron 'test kits' RT-qPCR para el diagnóstico clínico, y el Centro Chino para la Prevención y Control de Enfermedades (China CDC) recomendó el uso de cebadores y pruebas específicas para los genes ORF1 y N del virus SARS-CoV-2. Algunos estudios mostraron buenos resultados, tanto positivos como negativos (Chu et al., 2020 como se citó en Li et al., 2020), a pesar de que resultados previos de otras investigaciones obtuvieron sensibilidades entre 50% y 79% dependiendo del protocolo usado, el tipo de muestra y el número de especímenes clínicos colectados (Yam et al. 2013, p.4521–4524, como se citó en Li et al., 2020). 
De esos mismos estudios también se establecen desventajas para la técnica, a saber, riesgos asociados a la retención y operación de las muestras del paciente, operaciones complicadas e incómodas para la detección, y largos tiempos de espera, por lo que se ve esencial mejorar la velocidad de la técnica RT-qPCR (Li et al., 2020). Li (2020), también plantea desventajas adicionales, como la incertidumbre sobre la presencia viable del virus, la reactividad cruzada con otras regiones genéticas no específicas, y la precisión brindada en el marco de tiempo durante las fases agudas de la infección.
 ​
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Los inmuno-ensayos de enzimas EIA (de sus siglas en inglés Enzyme Immunoassays), o los ensayos inmuno-absorbentes ligado a enzimas ELISA (de sus siglas en inglés enzyme-linked immunosorbent assays), son ensayos inmunológicos muy sensitivos, ampliamente usados en aplicaciones clínicas o en investigaciones. Un EIA puede detectar hasta un mínimo de 0.01 ng de un antígeno o anticuerpo. La velocidad es de varias horas, pero la técnica es de muy bajo costo, no genera desperdicio peligroso, y es una prueba de alta especificidad y sensibilidad.
Las pruebas mencionadas, son particularmente útiles para diagnóstico de actividad inmune; una persona que ha pasado un tiempo infectada comenzará a generar anticuerpos que pueden ser detectados.
Existe otras pruebas denominados similares a EAIs, y que son muy rápidos y brindan resultados en minutos. Se les conoce como 'Point Of Care Tests' (POCT); sin embargo, son generalmente menos específicos y sensibles que los EIAs.  Los POCT de baja sensibilidad son los que usamos en Colombia. De otro lado, hay test que son mucho más complejos que los EIA, toman más tiempo, pero son bastante precisos: los 'immunoblots' (Western Blot), que usan inmovilización de proteínas de patógenos, hacen enlace con anticuerpos del paciente en suero, y de ese modo entregan evidencia de la alta especificidad as la exposición del patógeno (Madigan, et. al, 2019).
En el caso del virus SARS-CoV-2, se encontró en estudios que, luego del primer día a partir de los síntomas, empiezan a darse anticuerpos. Durante los primeros 5.5 días de la enfermedad, la PCR tuvo mayor éxito que la prueba ELISA para IgM; pero a partir del día 5.5 lo contrario sucedió, y ELISA comenzó a dar mejores resultados que la PCR. También se vio que la combinación de ELISA para IgM usada en conjunto con PCR, detectó el 98.6% de los casos, versus el 51.9% de usar sólo PCR (Wilson, 2020). De otro lado, puede haber un retardo entre 14 y 28 días después de la aparición de los síntomas, para que los anticuerpos puedan ser específicamente identificados (Pang et al., 2020).
También Pang et al. (2020) destaca que estos métodos son efectivos en la determinación de la extensión de la infección, incluyendo la estimación de proporciones asintomáticas y de velocidad del ataque.
Una ventaja adicional del uso de ELISA en el caso del SARS-CoV-2, es que no hay una reactividad cruzada con otros coronavirus que causan infecciones respiratorias superiores. También se encontraron casos positivos dentro de un grupo familiar, donde la PCR dio resultados negativos, y los ensayos serológicos fueron positivos, confirmando la presencia de anticuerpos para infección asintomática.
 
Ventajas y Desventajas RT-qPCR
Ventajas

• Es una técnica altamente sensible y específica. 
• No requiere purificaciones y visualizaciones posteriores por electroforesis.
• Se lleva a cabo en un corto plazo (horas) comparada con la técnica tradicional RT-PCR. 
• Muchas empresas han desarrollado kits comerciales para la detección del SARS-CoV-2. 

Desventajas

• Se necesita entrenar personal especializado para llevarla a cabo.
• Su sensibilidad y especificidad depende del protocolo usado, el tipo de muestra, y el número de especímenes clínicos. 
• Hay riesgos de retención y manejo de las muestras
• Tiempos de espera de varias horas desde su aplicación hasta la obtención de los resultados.
• Posible reactividad cruzada con otras regiones genéticas no específicas
• Falta de precisión en el marco de tiempo durante las fases agudas de la infección.
• Altos costos que la pueden volver inviable en tiempos de crisis.

 
Ventajas y Desventajas ELISA
Ventajas 

• Es muy barata, y simple de usar por personal no especializado.
• Son métodos ampliamente usados. 
• No genera residuos peligrosos.
• Alta especificidad y sensibilidad.
• Para SARS-CoV-2, no hay una reactividad cruzada con otros coronaviruses que causan infecciones respiratorias superiores. 
• Puede desenmascarar falsos negativos lanzados por RT-qPCR. 
• Durante fases críticas de la infección puede ser más exitosa que la RT-qPCR. 
• Es efectiva en la determinación de la extensión de la infección, y ayuda a estimar las proporciones asintomáticas y de velocidad del ataque. 
• Muchos kits comerciales en desarrollo.

Desventajas 

• Falsos negativos en fases iniciales de la infección.
• Puede haber retardos de muchos días a la aparición de anticuerpos después de la aparición de los síntomas, generando falsos negativos. 
• Velocidad de varias horas. 

 
Conclusiones
No es simple apreciar las pruebas sin un contexto regional. Colombia comenzó a tener presencia de casos oficiales a partir del día 9 de marzo con dos personas infectadas, y hasta la fecha de este texto, 8 de abril, habían 2059 infectados, 54 muertos, y 123 personas recuperadas. El gobierno colombiano tomó medidas de aislamiento social por cuarentena a finales del mes de marzo, y los datos vienen mostrando un aparente aplanamiento de la curva de infección, lo que hace pensar que la estrategia ha dado frutos si se le compara con otros países de la región y del mundo. Sin embargo, aún es temprano para decir qué tanto impacto tendrá las acciones, dado que hay mucha desobediencia civil, sea por necesidad, o por intransigencia.  
Se podría pensar que la atención en hospitales y centros improvisados se viene dando a capacidad. Sin embargo, el sector salud ha mostrado estar resquebrajado durante esta crisis: el 7 de abril comenzó a incrementar el índice de deserción laboral médica por falta de recursos que les asegure su seguridad laboral frente al virus: se determinó que hay mucho personal médico que no ha recibido salario en meses en algunos departamentos importantes, hay denuncias de maltrato laboral. Todo esto evidencia una crisis económica del sector salud como nunca se había evidenciado. Debido a que una pandemia no da espera al sector salud, el costo de las pruebas diagnósticas y su versatilidad y facilidad de uso se vuelven un tema a revisar meticulosamente. 
Entre las pruebas RT-qPCR y ELISA, aparentemente la mejor opción para fases de diagnóstico del SARS-CoV-2 frente a la crisis del sector salud en Colombia es ELISA, para aquellos casos donde hay evidencia de patogénesis por coronavirus. 
Se sugiere que el uso de pruebas RT-qPCR sea supeditado a aquellos casos donde se sospeche que la prueba ELISA no será exitosa. 
Se sugiere el uso de ambas pruebas sólo en aquellos casos donde hay evidencia clínica que amerite dicha decisión, como, por ejemplo, haber aplicado ELISA a un paciente perfectamente sintomático para COVID-19 que estuvo presuntamente en contacto con personas con COVID-19, y no haber obtener resultados, ya que puede no haber presencia de anticuerpos, y es necesario practicar una RT-qPCR.
​
Referencias.
Baldwin, R., Weder, M. (2020). Economics in the Time of COVID-19. VoxEU.org eBook. CEPR Press.

Chu, D. K. W., Pan, Y., Cheng, S. M. S., Hui, K. P. Y., Krishnan, P., Liu, Y., Ng, D. Y. M., Wan, C. K. C., Yang, P., Wang, Q., Peiris, M., & Poon, L. L. M. (2020). Molecular Diagnosis of a Novel Coronavirus (2019-nCoV) Causing an Outbreak of Pneumonia. Clinical Chemistry, 66(4), 549–555. https://doi.org/10.1093/clinchem/hvaa029

De Groot RJ, Baker SC, Baric R, Enjuanes L, Gorbalenya AE, Holmes KV, Perlman S, Poon L, Rottier PJ, Talbot PJ, Woo PC, Ziebuhr J (2011). "Family Coronaviridae". In King AM, Lefkowitz E, Adams MJ, Carstens EB, International Committee on Taxonomy of Viruses, International Union of Microbiological Societies. Virology Division (eds.). Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Oxford: Elsevier. pp. 806–28. ISBN 978-0-12-384684-6.

Li, X., Geng, M., Peng, Y., Meng, L., & Lu, S. (2020). Molecular immune pathogenesis and diagnosis of COVID-19. Journal Of Pharmaceutical Analysis. doi: 10.1016/j.jpha.2020.03.001

Madigan, M. T., Bender, K. S., Buckley, D. H., Sattley, W. M., Stahl, D. A., & Brock, T. D. (2019). Brock biology of microorganisms (15th edition, global edition). Pearson.

Pang, Junxiong, Min Xian Wang, Ian Yi Han Ang, Sharon Hui Xuan Tan, Ruth Frances Lewis, Jacinta I-Pei Chen, Ramona A Gutierrez, et al. “Potential Rapid Diagnostics, Vaccine and Therapeutics for 2019 Novel Coronavirus (2019-NCoV): A Systematic Review.” Journal of Clinical Medicine 9, no. 3 (February 26, 2020): 623. https://doi.org/10.3390/jcm9030623.

Wilson, M. (2020). NEJM Journal Watch: Summaries of and commentary on original medical and scientific articles from key medical journals. Retrieved 8 April 2020, from https://www.jwatch.org/na51255/2020/03/31/serologic-tests-sars-cov-2-first-steps-long-road

Zhou, P., Yang, X.-L., Wang, X.-G., Hu, B., Zhang, L., Zhang, W., Si, H.-R., Zhu, Y., Li, B., Huang, C.-L., Chen, H.-D., Chen, J., Luo, Y., Guo, H., Jiang, R.-D., Liu, M.-Q., Chen, Y., Shen, X.-R., Wang, X., … Shi, Z.-L. (2020). A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature, 579(7798), 270–273. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2012-7